محصول انتخاب الگوی توأمان روشنگری و مبارزه، مصائب و مشکلاتی بود که پیش روی مجاهدان راه خدا قرار میگرفت که «سیدعلی خامنهای» نیز مصون از آن نبود. او به خوبی میدانست در مسیری قدم نهاده است که با مصائب و سختیهای فراوانی روبهرو خواهد شد. شش بار زندانی، بارها رفتن به بازجویی و تحقیق در ساواک و سرانجام تبعید و بیخانمانی، نتیجه ورود به این مبارزه الهی بود.
وی جزء نخستین افرادی بود که همگامی و فعالیت مبارزاتی را در دوره قبل از قیام ۱۵ خرداد ۱۳۴۲ آغاز کرد. در بهمن ۱۳۴۱، پس از همهپرسی لایحه انجمنهای ایالتی و ولایتی، آیتاللهالعظمی خامنهای و برادرش سیدمحمد مأمور رساندن گزارش آیتالله محمدهادی میلانی به امام خمینی (ره) در قالب نامه درباره واکنش مردم مشهد به این همهپرسی شدند.
در سال ۱۳۴۲ و در آستانه ماه محرم، امام خمینی (ره) وی را مأمور کرد پیامهایی را به آیتالله میلانی و علما، روحانیون و هیئتهای مذهبی خراسان در جهت تداوم نهضت و آگاهسازی مردم در قبال تبلیغات رژیم پهلوی انتقال دهد. امام خمینی (ره) در این پیامها خطمشی مبارزه را ترسیم کرده و از علما و روحانیون خواسته بود به منظور تبیین جنایات رژیم پهلوی، ذکر واقعه مدرسه فیضیه از روز هفتم محرم در منابر خوانده شود. آیتاللهالعظمی خامنهای خود نیز برای محقق کردن هدف و اجرای خطمشی امام خمینی (ره) راهی بیرجندــ که تحت نفوذ خاندان علم بودــ شد و در منابر و مجالس آن شهر درباره حادثه مدرسه فیضیه و سلطه رژیم صهیونیستی بر جوامع اسلامی سخنرانی کرد. به دنبال این سخنرانیها، وی در ۱۲ خرداد ۱۳۴۲ مقارن با هفتم ماه محرم ۱۳۸۳، دستگیر و در مشهد زندانی شد.
او از جمله روحانیونی بود که در ۱۱ دی ۱۳۴۲ تلگرامی به آیتالله سیدمحمود طالقانی، مهدی بازرگان و یدالله سحابی، که در حمایت از امام خمینی (ره) زندانی شده بودند، فرستاد. در همان زمان طلاب خراسانی حوزه علمیه قم با هدایت او، در اعتراض به ادامه حصر امام خمینی (ره) نامهای به حسنعلی منصور، نخستوزیر وقت، نوشته و منتشر کردند که از جمله آنها خود ایشان و ابوالقاسم خزعلی و محمد عبایی خراسانی بودند.
ایشان در بهمن ۱۳۴۲، مقارن با رمضان ۱۳۸۳ق برای تبلیغ و تبیین مسائل نهضت اسلامی راهی زاهدان شد. سخنرانیهای او در مساجد زاهدان و استقبال مردمی از آن، رژیم را بر آن داشت که ایشان را دستگیر کرده و به زندان قزل قلعهـ که در آن زمان محل بازداشت زندانیان سیاسی و امنیتی بودــ منتقل کند. در ۱۴ اسفند ۱۳۴۲ قرار بازداشت آیتاللهالعظمی خامنهای به قرار التزام به عدم خروج از حوزه قضایی تهران تبدیل و ایشان از زندان آزاد شد. از این پس تا پیروزی انقلاب اسلامی فعالیتهای وی همواره تحت نظارت مأموران امنیتی قرار داشت.
چند سال بعد در پی دستگیری و تبعید آیتالله سیدحسن قمی در فروردین ۱۳۴۶ که به دنبال سخنرانی ضد رژیم او در مسجد گوهرشاد صورت گرفت، آیتاللهالعظمی خامنهای از آیتالله میلانی خواست به این اقدام اعتراض کند. این اقدام وی سبب شد مأموران ساواک از حضور او در مشهد اطلاع یافته و در ۱۴ فروردین همان سال، در مراسم تشییع جنازه آیتالله شیخ مجتبی قزوینی، وی را دستگیر کنند و تا ۲۶ تیر همان در حبس ماند. در همین زندان است که «ترجمه کتاب الإسلام و مشکلات الحضارة سید قطب را در همین زندان شروع کردم. بیشترِ کتاب را ترجمه کردم؛ اما حالت دلتنگی و ناراحتی ناشی از ماندن مدتی طولانی در سلولی کوچک و تاریک که حالت یکنواختی و تکرار بر آن حکمفرما بود، مانع از آن شد که کار ترجمه را به اتمام برسانم و مقدمه را بنویسم. این کار بهصورت ناقص باقی ماند، تا اینکه در اثنای چهارمین زندان، آن را تکمیل کردم؛ لذا کار کتاب در یک زندان آغاز شد و در زندانی دیگر به پایان رسید.»
چهارمین بازداشت در فاصلهای کم در دوم مهرماه ۱۳۴۹ آغاز شد و ایشان مدتی را در زندان لشکر خراسان تنها زندان امنیتی مشهد سر میکند و در زمستان همان سال آزاد میشود. در اسفند ۱۳۴۹ با آنکه نام آیتالله خامنهای در فهرست واعظان ممنوعالمنبر ساواک قرار گرفته بود، وی سخنرانیهایی در هیئت انصارالحسین تهران ایراد کرد. آیتاللهالعظمی خامنهای در سال ۱۳۵۰ به دعوت آیتالله طالقانی سخنرانیهایی در مسجد هدایت تهران، که کانون توجه دانشجویان و جوانان مبارز بود، ایراد کردند.